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  • 服务热线400-065-1811

    产品简介

    日本排球女将全集下载 www.hpsux.tw 全转录组是指特定细胞在特定状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括mRNA和非编码RNA(non-coding RNA)。针对非编码RNA的研究主要集中在具有调控作用的miRNA,lncRNA和circRNA?;诙庑蚣际醯娜甲椴庑蜓芯?,同时分析同一样本中的mRNA,lncRNA,circRNA,miRNA,并且通过两两关联分析、三元关联分析、多元关联分析,使研究内容更加系统化,致力于深入挖掘生命现象背后的转录调控问题。



    ceRNA(竞争性内源RNA)机制示意图

    Wang Y et al., Trends Genet, 2016

    我们的优势

    1. 双文库构建:small RNA文库和去核糖体的链特异性文库,烈冰 8年建库经验,保证建库质量;

    2. 4种RNA全方位分析:不仅能定量分析已知的lncRNA和miRNA,还能通过Stringtie重建转录本预测新的lncRNA;并通过预测的circRNA进行靶向分析 ,从而得到miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA、以及circRNA-miRNA的靶向关系;

    3. 数据库全面整合:整合并定时升级国际公认数据库和靶基因预测算法,如NP Inter、miRBase、RNAhybrid等,保证分析结果紧跟国际最前沿;

    4. 上游测序+下游验证:客户只需提供细胞,组织或者总RNA,烈冰为您完成从上机测序到数据分析整套服务流程,同时可进行后续qPCR验证。



    样本要求

    组织样品:

    1. 动物组织≥1g;

    2. 植物组织≥2g;

    3. 细胞样品≥1×106个;

    4. 全血≥5mL;

    5. 菌体≥106个或≥30mg。

    RNA样品:

    1. 样品需求量: RNA≥10 μg;

    2. 样品浓度:RNA样品≥100 ng/μl;

    3. 样品纯度:OD260/OD280在1.8-2.2之间,OD260/OD230≥2,28S/18S≥1,动物样品RIN≥7.0,植物样品RIN≥6.5,RNA无明显降解。


    实验流程


    1. 客户样本:细胞量在106以上;

    2. RNA提取及质控:凝胶电泳质控→Nanodrop质控→Agilent 2200质控;

    3. small RNA文库构建:切胶范围10-50bp,单端测序SE50,文库分子18-30bp;

    4. 去核糖体文库构建:逆转录后用RNase处理,去除rRNA;

    5. 上机测序:烈冰建议选择NovaSeq,双端测序,通量大,碱基精度高,而且成本低,速度快。



    数据分析流程

    结果示例

    1、mRNA数据分析结果展示详见“转录组测序”

    2、miRNA数据分析结果展示详见“small RNA测序”

    3、LncRNA鉴定和差异lncRNA分析
    以RNA mapping得到的counts为研究对象,采用NCBI Gene/Ensembl Biomart/NONCODE等数据库的Genetype注释信息,对已知的lncRNA/假基因/其它长链非编码RNA进行鉴定。随后,以这些lncRNAs 的counts为研究对象,采用DESeq2/DESeq/EBSeq/EdgeR/Limma等算法进行差异筛选,得到满足差异倍数以及FDR阈值的差异基因(Dif-lncRNA)。并基于差异筛选结果,进行火山图以及聚类分析,得到Volcano Plot和Cluster Heatmap。

    差异lncRNAs火山图分析和聚类分析

    Yang F et al., Gene, 2016

    注:(A)差异lncRNA火山图分析结果,红色表示显著差异的lncRNA,蓝色表示非显著差异的lncRNA;(B)差异lncRNA聚类分析的Heat map,红色越深表示lncRNA上调越显著,蓝色越深表示lncRNA下调越显著。



    4、lncRNA靶向分析
    以差异lncRNAs、差异miRNAs为研究对象,采用miRanda算法和RNAhybrid算法进行靶基因预测,得到lncRNA-miRNA靶向作用关系。

    lncRNA-miRNA靶向作用关系

    Miao X et al., Sci Rep, 2016

    注:红色三角表示上调lncRNAs,绿色三角表示下调lncRNAs,紫色V型三角表示上调miRNAs,蓝色V型三角表示下调miRNAs。



    5、ceRNA分析
    以lncRNA-miRNA靶向关系为研究对象,再联合miRNA靶向基因的信息,采用负相关分析方法,得到lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA关系,并绘制lncRNA-miRNA-mRNA Network。

    lncRNA-miRNA-mRNA Network

    Miao X et al., Sci Rep, 2016

    注:紫色三角形表示lncRNA,红色圆点表示mRNA,黄色圆点表示关键mRNA,蓝色V型三角表示miRNA。



    6、ceRNA基因功能分析(GO Analysis)和信号通路分析(Pathway Analysis)
    以ceRNA为研究对象,分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库,以及KEGG数据库,对差异基因进行功能分析和信号通路分析,从而得到ceRNA基因所显著富集的功能条目和pathway条目。

    差异基因GO分析和Pathway分析

    Xu T et al., Oncogene. 2015

    注:(a)lncRNA TINCR-siRNA VS scrambled siRNA差异基因聚类分析图;(b)差异基因显著富集的pathway条目;(c)差异基因显著富集的GO条目。



    7、circRNA预测
    环状RNA(circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型RNA,具有闭合环状结构。我们根据circRNA在表达过程中的特殊剪接形式,采用circexplorer/CIRI/ACFS/find_circ等算法,对测序得到的reads进行circRNA预测,可以发现同时覆盖两个外显子且方向与线性RNA相反的circRNA,以及一些Intergenic或者Intron区域来源的新的circRNA。

    circRNA预测工作流和预测结果(正常组织 VS 癌组织)

    Chen W et al., Nat Neurosci. 2015/Zheng Q et al., Nature Communications, 2016

    注:(a)横坐标表示circRNA反向剪接reads数,纵坐标表示circRNA数量;(b)circRNA在基因组结构上的分布;(c)横坐标表示exonic circRNA长度,纵坐标表示circRNA数量。



    8、差异circRNA分析
    以预测的circRNA为研究对象,采用DESeq2/DESeq/EBSeq/EdgeR/Limma等算法进行差异筛选,得到满足差异倍数(Log2FC>1或<-1)以及FDR阈值(FDR<0.05)的差异circRNA(Dif-circRNA)。

    差异circRNA分析结果

    Liu Q et al., Scientific Reports, 2016

    注:左图为差异circRNA的聚类分析图(OA VS normal软骨组织);右图为差异circRNA的火山图,红点表示差异显著的circRNA。


    9、circRNA靶向分析
    以差异circRNA为研究对象,采用miranda算法与RNAHybrid算法进行靶向调控关系预测,得到miRNA与差异circRNA靶向调控关系。

    circRNA-miRNA相互作用

    Zheng Q et al., Nature Communications, 2016

    注:该图展示了circHIPK3相互作用的miRNAs的假定结合位点。



    10、ceRNA分析
    以circRNA-miRNA靶向关系为研究对象,再联合miRNA靶向基因的信息,采用负相关分析方法,得到circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA关系,并绘制circRNA-miRNA-mRNA Network。

    circRNA-miRNA-mRNA Network

    Liu Q et al., Scientific Reports, 2016

    注:绿色圆点表示circRNA,黄色菱形表示mRNA,紫色V型三角表示miRNA。


    11、WGCNA功能预测
    加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)是一个基于基因表达数据,构建基因共表达网络的方法。NovelBio团队协助研究者利用WGCNA进行功能预测,根据基因表达模式,将基因进行分组。根据“凡是能够互相形成共表达关系并且成簇的基因,具有类似的功能”,可以认为circRNA和它所属簇中mRNA具有类似的功能,并且可以通过mRNA所富集功能和信号通路对circRNA对于表型的影响进行预测。

    circRNA和蛋白编码基因的WGCNA分析

    Wang Z  et al. Frontiers in plant science, 2017

    注:该图为WGCNA计算出来的不同module,与不同表型相关性高的module,并对moudle16以及两个circRNA的关系网络图分别进行了可视化展示。


    高级数据分析
    1、 韦恩分析(Venn Analysis)
    以实验中需解决的科学问题为研究目标,以每两组间的差异mRNA,lncRNA,circRNA、miRNA为研究对象,采用韦恩分析方法,得到每两组中独有或共有的mRNA、lncRNA,circRNA、miRNA。


    E50 VS E40E60 VS E50差异mRNA/lncRNA韦恩图

    Li Y et al., BioMed Research International. 2019

    注:左图为E50 VS E40差异mRNAE60 VS E50差异mRNA的韦恩分析结果;右图为E50 VS E40差异lncRNAE60 VS E50差异lncRNA的韦恩分析结果。



    2、 lncRNA/circRNA基因富集分析
    为了从庞杂的组学数据中发掘规律,研究lncRNA/circRNA的生物功能,NovelBio团队为研究者定制基因富集分析(Gene set enrichment analysis, GSEA),找到起关键作用的生物通路,进一步确定研究的lncRNA/circRNA与表型相关的生物学机制。

    干预LncRNA GAS5的基因富集分析

    Liu et al., Nat Commun, 2016

    注:该图为LncRNA GAS5过表达和敲低后,hESCs的基因富集分析结果。其中,ES表示富集度得分,NES表示ES标化后的值,得分越高表示该基因类别与该干预呈正相关。



    文献示例

    [1] Lei B, Zhou J, Xuan X, et al. Circular RNA expression profiles of peripheral blood mononuclear cells in hepatocellular carcinoma patients by sequence analysis. Cancer Med. 2019 Feb 4. (IF=3.202)


    [2] Li Y, Li GQ, Wang F, et al. Integrated Analysis of LncRNA-mRNA Coexpression in the Extracellular Matrix of Developing Deciduous Teeth in Miniature Pigs. BioMed Research International. 2019 Jan 23. (IF=2.583)


    [3] Yu Y, Zhang M, Liu J, et al. Long Non-coding RNA PVT1 Promotes Cell Proliferation and Migration by Silencing ANGPTL4 Expression in Cholangiocarcinoma. Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Dec 7;13:503-513. (IF=5.66)


    [4] Qu S, Hao X, Song W, et al. Circular RNA circRHOT1 is upregulated and promotes cell proliferation and invasion in pancreatic cancer. Epigenomics. 2018 Nov 16;11(1):53-63. (IF=4.979)


    [5] Yu Y, Zhang M, Wang N, et al. Epigenetic silencing of tumor suppressor gene CDKN1A by oncogenic long non-coding RNA SNHG1 in cholangiocarcinoma. Cell Death Dis. 2018 Jul 3; 9(7):746-758. (IF=5.638)


    [6] Yin D, Lu X, Su J, et al. Long noncoding RNA AFAP1-AS1 predicts a poor prognosis and regulates non-small cell lung cancer cell proliferation by epigenetically repressing p21 expression. Mol Cancer. 2018 May 24;17(1):92. (IF=7.776)


    [7] Liang Ding,et al. A novel stromal lncRNA signature reprograms fibroblasts to promote the growth of oral squamous cell carcinoma via LncRNA-CAF/interleukin-33. Carcinogenesis. 2018 Mar 8;39(3):397-406. (IF=5.105)


    [8] Sun D,et al.LncRNA GAS5 inhibits microglial M2 polarization and exacerbates demyelination. EMBO Rep. 2017 Oct;18(10):1801-1816. (IF=8.568)


    [9] Lai, Z.Y. et al. Analysis of co-expression networks for circular RNAs and mRNAs reveals that circular RNAs hsa_circ_0047905, hsa_circ_0138960 and hascircRNA7690-15 are candidate oncogenes in gastric cancer. Cell Cycle. 2017 Oct 5:1-11. (IF=3.53)


    [10] Zhang E, et al. H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma. Nucleic Acids Res.  2017 Apr 7;45(6):3086-3101.. (IF=10.162)


    [11] Xu C, et al. Long non-coding rna gas5 control human embryonic stem cell self renewal by maintaining nodal signaling. Nat Commun. 2016 Nov 4;7:13287. (IF=12.124)


    [12] Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016 Apr 6;7:11215. (IF=11.47)


    [13] Liu Q, et al. Circular RNA Related to the Chondrocyte ECM Regulates MMP13 Expression by Functioning as a MiR-136 ‘Sponge’ in Human Cartilage Degradation. Sci Rep. 2016 Mar 2;6:22572. (IF=5.578)


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